Die Geschichte der Hof-Apotheke begann vor über 600 Jahren im Jahre 1413, in einem Seitenflügel des Alten Schlosses in einer nicht-öffentlichen Arzneikammer unter Leitung des „ehrbaren und fürsichtigen“, Meisters Heinrich Glatz. Er leitete die „Arzneikammer“ im „Nebenamt“ und hatte zugleich eine öffentliche Apotheke in der Stadt Stuttgart. Arzneiabgabe durfte nur an den Grafen Eberhard IV. von Württemberg und seine Frau Henriette von Mömpelgard, den Hof und die Kanzlei (königliche Schreibstube) erfolgen.

Fast 150 Jahre später im Jahr 1551 wurde die Apotheke von Markgräfin Anna Maria von Brandenburg-Ansbach, der Gemahlin Herzog Christophs von Württemberg (seit 1495 war Württemberg zum Herzogtum erhoben worden) als eine Stiftung ins Leben gerufen, „um“ – wie es in den Gründungsurkunden heißt – „die Kranken mit Arzneien zu versehen“. Es handelte sich um eine Stiftung für Arme, Kranke und Notleidende der Stadt unter Leitung von Cyriakus Horn III. Später wurde u. a. das königliche Waisenhaus mit kostenlosen Medikamenten versorgt.

Neben Anna Maria von Brandenburg spielten auch andere Frauen eine Rolle in der Geschichte der Hof-Apotheke. 1582 wurde Helene Ruckher zur Hof-Apothekerin ernannt, zur damaligen Zeit waren Frauen in diesem Beruf selten. Helene Ruckher leitete 12 Jahre die Apotheke bis zu ihrem selbstgewählten Ruhestand. Ihr folgten weitere Apothekerinnen, die aber zumeist im Gefolge der Herzogin waren, sich also mit ihr im Schloss in Nürtingen aufhielten und nicht in der Hof-Apotheke in Stuttgart. Anfang des 17. Jahrhunderts war es Maria Andreae, die der Hof-Apotheke zu einem guten Ruf verhalf.

Ende des 18. Jahrhunderts zog die Hof-Apotheke vom Seitenflügel des Alten Schlosses in die Räume des Krankenzimmertraktes in die Hohe Karlsschule, der ersten Universität der Stadt Stuttgart.

1820 zog die Hof-Apotheke in die Schlosskapelle im Alten Schloss, die auf Erlass Herzog Christophs speziell hierfür umgebaut wurde.

1865 wurde die Hof-Apotheke auf Geheiß von König Wilhelm I. in die Alte Kanzlei am Schillerplatz 5 in Stuttgart verlegt. Die Alte Kanzlei war die gräfliche Schreibstube, später Sitz der württembergischen Verwaltungsbehörde.

1910–1955 war Karl Fuchs Inhaber der Hof-Apotheke. Er war der erste Pächter der nun selbst verwalteten Hof-Apotheke. Den Titel Hofrat erhielt Fuchs 1918 von König Wilhelm II. von Württemberg für seine verdienstvolle Arbeit. Nach Auflösung der Monarchie Ende des Ersten Weltkrieges 1918 ging die vormalige Königliche Hofapotheke an die Württembergische Staatsfinanzverwaltung über.

Im Zweiten Weltkrieg wurden die Alte Kanzlei und die Hof-Apotheke durch Fliegerbomben in der Nacht vom 12. auf 13. September 1944 fast völlig zerstört.

Nach dem Ende des Zweiten Weltkrieges wurde die Hof-Apotheke 1947 zuerst in ihren ehemaligen Räumen in der Ruine der Alten Kanzlei untergebracht. Während die Alte Kanzlei wiederaufgebaut wurde, zog die Hof-Apotheke 1951 vorübergehend in die Ruine des Kronprinzenpalais. 1955 war die Alte Kanzlei fertiggestellt, und Hofrat Fuchs zog mit der Hof-Apotheke in die neuen Räume in der Alten Kanzlei ein.

Fuchs betrieb eine allopathische und homöopathische Apotheke und wurde 1955 von seinem Schwiegersohn Wilhelm Spindler abgelöst. Bis in die 1980er Jahre blieben der homöopathische und der allopathische/schulmedizinische Bereich räumlich voneinander getrennt.

Seit Mitte der 1950er Jahre befindet sich die Hof-Apotheke wieder in den historischen Räumen der Alten Kanzlei, zentral gelegen zwischen Schloss- und Schillerplatz. Die Modernisierung der Innenräume in den 1990er Jahren vermochte Modernes mit Historischem zu verbinden und blieb dem hergebrachten Erscheinungsbild der Apotheke treu.

Seit 1989 steht die Apotheke unter der Leitung von Apotheker Jan Tomsky. Die Apotheke verfügt heute wie damals über ein umfangreiches homöopathisches und allopathisches/schulmedizinisches Sortiment. Für die homöopathische Abteilung hat die Hofapotheke die Genehmigung zur Versandapotheke und betreibt damit Deutschlands größten Onlineshop für homöopathische Einzel- und Komplexmittel.